Metoda Sanger za sekwencjonowanie DNA


Sanger Method for DNA Sequencing
Copyright © By Elizabeth Canfield
For original English text, go to: http://www.bio.davidson.edu/courses/Bio111/seq.html

Sekwencjonowanie DNA, pierwszy opracował w 1975 roku, stała się potężną techniką biologii molekularnej, umożliwiając analizę genów na poziomie nukleotydów. Z tego powodu narzędzie to zostało zastosowane w wielu dziedzinach badań. Na przykład, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), to metoda, która szybko wytwarza liczne kopie pożądanego fragmentu DNA, wymaga przede znając towarzyszących sekwencje tego utworu. Innym ważnym wykorzystanie sekwencjonowanie DNA jest określenie miejsca restrykcyjne w plazmidów. Znajomość tych miejsc restrykcyjnych jest przydatna w klonowanie obcego genu do plazmidu. Przed pojawieniem się sekwencjonowanie DNA, biologów molekularnych musiał sekwencji białek bezpośrednio, teraz sekwencje aminokwasów można ustalić łatwiej przez sekwencjonowanie fragment cDNA i znalezienie otwartą ramkę odczytu. W ekspresji genów eukariotycznych, sekwencjonowanie pozwoliło naukowcom zidentyfikować zakonserwowanych motywów sekwencji i określić ich znaczenie w regionie promotora. Ponadto, biolog molekularny może korzystać kolejności zidentyfikować miejsce mutacji punktowej. Są to tylko niektóre przykłady ilustrujące, w jaki sposób sekwencjonowanie DNA zrewolucjonizowały biologii molekularnej.
Dideoxynucleotide sekwencjonowanie reprezentuje tylko jedna metodę sekwencjonowania DNA. To jest powszechnie nazywany Sanger sekwencjonowanie ponieważ Sanger opracowali metodę. Technika ta wykorzystuje 2 ‘, 3′-dideoxynucleotide triphospates (ddNTPs), molekuły, które różnią się od deoksynukleotydy przez posiadające atom wodoru dołączonego do 3’ węglem raczej niż OH grupy. (Rys. 1). Cząsteczki te wypowiedzenia wydłużenie łańcucha DNA, ponieważ nie mogą tworzyć wiązania fosfodiestrowego z następnym deoxynucleotide.

W celu przeprowadzenia sekwencjonowanie, trzeba najpierw przekonwertować dwuniciowy DNA w jednej nici DNA. Można to zrobić przez denaturacji podwójnej nici DNA z NaOH. Reakcja Sanger składa się z następujących czynności: nić się sekwencyjnie (jeden z pojedynczych nici, który denaturowano pomocą NaOH), DNA primery (krótkie fragmenty DNA, które są zarówno komplementarne do nici, która ma być sekwencjonowane i radioaktywnie oznakowane 5 end “), mieszanka konkretnej ddNTP (np. ddATP) z normalnym dNTP ust dATP w tym przypadku), a pozostałych trzech dNTP w dCTP, dGTP i dTTP). Stężenie ddATP powinien wynosić 1% stężenia dATP. Logika tego wskaźnika jest to, że po polimeraza DNA dodaje, polimeryzacja odbędzie się i zakończy kiedykolwiek ddATP jest włączona do pasma rośnie. Jeśli ddATP jest tylko 1% całkowitej koncentracji dATP, cała seria oznaczonych pasma spowoduje (rys. 1). Zauważ, że długość tych pasm są zależne od lokalizacji w stosunku do bazowej końcu 5 ‘.

Reakcja ta odbywa się cztery razy używając innej ddNTP dla każdej reakcji. Gdy reakcje te są zakończone, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) jest wykonywana. Jeden Reakcja jest ładowany do jednego pasa ruchu dla w sumie cztery pasy ruchu (rys. 2). Żel jest przenoszony do filtra nitrocelulozy i autoradiografii odbywa się tak, że tylko zespoły z radioaktywnym etykiety na końcu 5 ‘pojawi. Na stronie, najkrótsze fragmenty będą migrować najdalej. Dlatego też od dołu do najbardziej zespół wskazuje, że jego szczególną dideoxynucleotide został dodany najpierw do oznaczonego podkładu. Na rysunku 2, na przykład zespół, który wyemigrowali najdalej był w mieszaninie ddATP reakcji. Dlatego ddATP musi zostały dodane najpierw do podkładu, a jego uzupełnieniem bazy, tymina, musiała być obecna baza na 3 ‘końcu uporządkowanego części. Można kontynuować czytanie w ten sposób. Uwaga na rysunku 2, że jeżeli ktoś czyta podstawy od dołu do góry, jeden czyta 5 ‘do 3’ sekwencji nici komplementarnej na taśmę sekwencjonowaniu. Sekwencjonowane nić można odczytać 5 ‘do 3’, czytając od góry do dołu podstawy komplementarne do tych na żelu.

Comments are closed.